Cara Melakukan Uji Pewarnaan Gram Pada Bakteri

Pewarnaan gram merupakan salah satu metode pengujian bakteri untuk menentukan apakah bakteri tersebut termasuk ke dalam bakteri Gram positif atau gram negatif. Pewarnaan gram pertama kali ditemukan oleh seorang ahli bakteriologi berkebangsaan Denmark yang bernama Chirstian Gram. Bakteri gram positif akan menghasilkan warna biru atau ungu, hal ini disebabkan olehkompleks warna kristal violet-iodin. Sedangkan bakteri Gran negatif berwarna merah atau merah muda yang disebabkan oleh tidak mampu mempertahankan kompleks warna tersebut saat diberi larutan etanol 95 % dan pewarna safranin dapat masuk sehingga berwarna merah (Volk dan Wheeler, 1993).

Langkah pewarnaan Gram adalah sebagai berikut:

1. Tahap awal yang harus dilakukan pada pewarnaan gram yaitu mengambil isolat murni pada media TSA dengan menggunakan jarum ose.

2. Selanjutnya bakteri diletakkan pada preparat dan dilakukan pewarnaan, langkah ini dilakukan sebanyak tiga kali sehingga pada preparat terdapat tiga kali pewarnaan dengan sebelumnya preparat diberikan akuades.

3. Setelah kering difiksasi agar bakteri pada preparat mati tetapi tidak merusak struktur sel nya, kemudian ditetesi kristal ungu dan ditunggu satu menit. Pemberian kristal ungu adalah sebagai pewarna primer. Setelah itu preparat dibilas untuk mencuci kristal ungu.

4. Lalu diberi iodium untuk memperkuat warna dan didiamkan kembali satu menit dan dibilas.

5. Kemudian diberi alkohol 70% untuk melarutkan lemak dan dibilas dengan air untuk menghilangkan sisa alkohol yang tidak terpakai.

6. Kemudian pemberian safranin sebagai warna sekunder dan dibiarkan selama 30 menit dan dibilas dengan air dan ditetesi minyak imersi untuk memperjelas indeks bias kemudian diamati dengan mikroskop. 

Perbedaan hasil pewarnaan tersebut disebabkan oleh perbedaan struktur dinding sel dan komposisi dinding sel dari kedua kelompok bakteri tersebut. Dinding sel bakteri Gram positif memiliki peptidoglikan yang tebal sehingga mampu mempertahankan warna kompleks tersebut. Sedangkan dinding sel bakteri Gram negatif memiliki kandungan lipid yang banyak sehingga ketika diberi larutan etanol 95% akan larut sehingga warna ungu dari kristal violet menjadi luntur sehingga safranin dapat mewarnai bakteri tersebut (Volk dan Wheeler, 1993). 

Sumber: Volk, Wesley A. dan Wheeler, M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar. Erlangga :Jakarta.

Prosedur Kerja Pengujian Bakteri Escherechia coli

Prosedur pengujian Escherechia coli di Balai KIPM Kelas II Semarang sesuai dengan SNI 01-2332.1-2006 dan SNI 2332.1:2015 prinsipnya yaitu menumbuhkan bakteri dalam suatu media cair dan perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif setelah diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Metode yang digunakan untuk menghitung jumlah bakteri yaitu menggunakan metode Angka Paling Memungkinkan (APM). Metode APM yaitu mikroba dihitung dengan menggunakan media cair dalam tabung reaksi umumnya pengenceran dengan 3 seri tabung. Kemudian dilanjutkan dengan tes lanjutan IMVIC. Skema kerja pengujian mikrobiologi bakteri Escherechia coli dapat dilihat pada Gambar 19.

                                   Gambar 19.  Skema Pengujian Bakteri Escherechia coli

(SNI 01-2332.1-2006)

Sumber : Badan Standarisasi Nasional.2006. SNI 01-2332.1-2006)

Tahapan Pengujian Bakteri Escherechia coli

a.   Uji Pendugaan Coliform (Presumtive Coliform)

·     Siapkan pengenceran 10² dengan cara melarutkan 1 mL larutan 10¹ ke dalam 9 mL larutan pengencer BFB sampai pengenceran 10³. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali.

·      Diambil sebanyak 1 mL larutan dari setiap pengenceran menggunakan pipet steril ke dalam 3 tabung LTB yang berisi tabung durham 3 seri.

·      Selanjutnya tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 35^oC ± 0,5^oC. Gas yang terbentuk setelah inkubasi 24 jam ± 2 jam diamati. Tabung positif ditandai dengan keruhan dan gas dalam tabung durham. Diinkubasikan kembali tabung-tabung negatif selama 24 jam dan dicatat hasilnya pada 48 jam ± 3 jam.

·      Dilakukan uji penegasan koliform untuk tabung-tabung positif. Kegiatan Uji Pendugaan Coliform dapat dilihat pada Gambar 21.

                                                   Gambar 21. Uji Pendugaan Coliform

(Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

b.  Uji Pendugaan E. coli (Faecal Coliform, Presumtive E. coli)

·      Inokulasikan dari setiap tabung LTB yang positif ke tabung-tabung EC broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose. Diinkubasi EC broth dalam waterbath sirkulasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 45.5^oC ± 0,2^oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi.

·      Tabung-tabung EC broth yang menghasilkan gas selama 24 jam ± 2 jam diperiksa, jika negatif diinkubasikan kembali dan diperiksa pada 48 ± 2 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.

·      Ditentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) untuk fekal koliform berdasarkan jumlah tabung-tabung EC yang positif. Nilai APM fekal koliform dinyatakan sebagai APM/g untuk produk perikanan. Pengujian menggunakan 3 seri tabung pengenceran. Kegiatan Uji Pendugaan Escherechia coli dapat dilihat pada Gambar 22.

                                        Gambar 22. Uji Pendugaan Escherechia coli

(Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

c. Uji Penegasan E. coli (Confirmed E. coli)

·      Sampel dari tabung-tabung EC broth yang positif digoreskan menggunakan jarum ose gores ke L-EMB agar. Inkubasi selama 18 – 24 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC.

·      Koloni E. coli terduga memberikan ciri yang khas (typical) yaitu hitam pada bagian tengah, datar dan dengan atau tanpa hijau metalik.

·      Diambil sampai dengan 5 koloni tipikal E. coli dari masing-masing cawan L-EMB agar dan goreskan ke media PCA miring dengan menggunakan jarum ose. Inkubasi selama 18 – 24 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC, koloni dari media PCA miring digunakan untuk pengujian selanjutnya. Kegiatan Uji Penegasan Escherechia coli dapat dilihat pada Gambar 23.

Gambar 23. Uji Penegasan Escherechia coli

 (Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

d. Uji Morfologi

     Dilakukan uji morfologi dengan melakukan pewarnaan gram dari setiap koloni Escherechia coli terduga. Biakan diambil dari PCA yang telah diinkubasi selama 24 jam. Setelah itu diamati dengan menggunakan mikroskop. Bakteri Escherechia coli  termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek atau coccus. Prosedur pewarnaan gram pada Bakteri Escherechia coli  sesuai dengan Standar Nasional Indonesia 2332.1-2006 adalah sebagai berikut:

·      Buat usapan bakteri yang akan diwarnai ke atas gelas preparat. Usahakan usapan yang dibuat setipis mungkin.

·      Fiksasi gelas preparat tersebut dengan melewatkan melalui api burner.

·      Warnai film selama 1 menit dengan larutan Hucker’s Crystal violet dan cuci sebentar dengan air.

·      Bubuhkan larutan gram iodine selama 1 menit dan cuci dengan air mengalir.

·      Lakukan dekolorisasi (penghilangan warna) dengan Ethanol 95% hingga seluruh warna biru hilang (kira-kira 30 detik). Cuci kembali dengan air mengalir.

·      Bubuhkan larutan counterstain (safranin) selama 1 menit dan cuci kembali dengan air mengalir. Selanjutnya dikeringkan dan amati dengan mikroskop. Kegiatan Uji Morfologi Escherechia coli dapat dilihat pada Gambar 24.

Gambar 24. Uji Morfologi Escherechia coli

(Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

e. Uji Biokim

·      Produksi Indol

          Diinokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam tryptone broth dan diinkubasikan selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC. Uji indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 mL – 0,3 mL pereaksi Kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning.

·      Uji Voges Proskauer

     Diinokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam MRVP broth. Selanjutnya diinkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC. Diambil sebanyak 1 mL dari setiap MRVP broth yang tumbuh ke tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm steril dan ditambahkan 0,6 mL larutan alpha naphtol dan 0,2 mL 40% KOH, kocok dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif jika terbentuk warna merah muda eosin sampai merah delima (ruby).

·      Uji Methyl Red

    Diinkubasikan kembali MRVP broth selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC. Ditambahkan 5 tetes indikator methyl red pada setiap MRVP broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna kuning.

·      Uji Sitrat

     Digoreskan 1 ose dari PCA miring ke permukaan Simmon Citrate agar. Selanjutnya diinkubasikan selama 96 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC. Reaksi positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau.

·      Produksi Gas dari Laktosa

     Diinokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam LTB. Lalu diinkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC. Reaksi positif jika menghasilkan gas pada tabung durham. Kegiatan Uji Biokim Escherechia coli dapat dilihat pada Gambar 25.

                                                 Gambar 25. Uji Biokim Escherechia coli

(Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

Pereaksi Pengujian Bakteri Escherechhia coli

Pereaksi  yang digunakan dalam pengujian bakteri Escherechhia coli yaitu Kovacs, Alpha naphtol, KOH 40%, Methyl red  untuk uji IMVIC dan reagen pewarnaan gram untuk uji morfologi. Langkah pembuatan pereaksi yang digunakan untuk uji bakteri Escherechia coli adalah sebagai berikut:

a.   Pereaksi Kovacs

     Siapkan p-Dimethylaminobenzaldehyde 5 g, amyl alcohol 75 ml, dan HCl (concentrate) 25 ml. Langkah pembuatannya yaitu larutkan p-Dimethylaminobenzaldehyde dalam amyl alcohol. Pelan-pelan tambahkan HCl. Simpan pada suhu 4 C. Untuk uji Indol tambahkan 0,2 ml - 0,3 ml ke dalam kultur bakteri dalam tryptone broth. Warna merah pada permukaan lapisan menunjukkan reaksi positif. Pereaksi  Kovac dapat dilihat pada Gambar 14.

                           Gambar 14. Pereaksi  Kovac (Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

b.  Pereaksi Alpha Naphtol

     Siapkan naphtol 2,5 g dan ethanol 50 ml. Langkah pembuatannya yaitu timbang naphtol 2,5 g tambahkan ethanol 50 ml kemudian dihomogenkan. Pereaksi  Alpha naphtol dapat dilihat pada Gambar 15.

Gambar 15. Pereaksi  Alpha naphtol (Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

c.   KOH 40%

     Siapkan KOH 40 g dan aquades 100 ml. Langkah pembuatannya yaitu timbang KOH 40 g tambahkan aquades 100 ml kemudian dihomogenkan. Pereaksi  KOH 40% dapat dilihat pada Gambar 16.

                   Gambar 16. Pereaksi  KOH 40% (Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

d.  Pereaksi Methyl red

     Siapkan methyl red 0,01 g, alcohol 96% 20 ml dan aquades 30 ml. Langkah pembuatannya yaitu timbang methyl red 0,01 g tambahkan alcohol 96% 20 ml dan aquades 30 ml kemudian dihomogenkan. Pereaksi  Methyl red dapat dilihat pada Gambar 17.

Gambar 17. Pereaksi  Methyl red (Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

e.   Reagen Pewarnaan Gram

·      Hucker’s  Crystal violet

Buat larutan A dengan cara meniimbang crystal violet  2 g tambahkan Ethyl alcohol 95% 20 ml kemudian dihomogenkan. Selanjutnya buat larutan B dengan cara menimbang ammonium oxalat 0,8 g  dan tambahkan aquades 80 ml kemudian dihomogenkan. Setelah itu campurkan larutan A dan B, simpan selama 24 jam dan saring menggunakan kertas saring.

·      Gram’s Iodine

Siapkan Iodine 1 g, Potassium Iodine 2 g, dan aquades 300 ml. Masukkan KJ dalam mortar,  tambahkan Iodine dan gerus dengan alat penggiling selama 5 detik-10 detik. Tmbahkan 1 ml air dan gerus kemudian tambahkan 5 ml. Tambahkan lagi 10 ml dan gerus. Tuang larutan ini dalam botol pereaksi. Bilas mortar dan alat penggilingnya dan tambahkan air hingga volume 300 ml.

·      Hucker’s counterstain (larutan stok)

Siapkan safranin O 2,5 g dan Ethanol 95%. Langkah pembuatan pereaksinya dengan melarutkan 10 ml larutan stok ke dalam 90 ml aquades.

Media Pertumbuhan Bakteri Escherechia coli

    Adapun media-media yang digunakan pada pengujian mikrobiologi bakteri Escherechia coli diantaranya BFB, LTB, EC Broth, L-EMB Agar, PCA Miring, Citrat, Indol, MR-VP.

a.   Larutan Butterfield’s Phospate Buffered (BFB)

     Pada pengujian mikrobiologi bakteri Escherechia coli,  BFB digunakan untuk pengkayaan dan pengenceran. Komposisi BFB yaitu KH₂PO₄ 34 g dan aquades 500 ml (SNI 2332:2006). Berdasarkan petunjuk penggunaan pada kemasan produk media BFB di Balai KIPM Kelas II Semarang, sebelum membuat larutan kerja BFB terlebih dahulu membuat larutan stok.

    Bahan dasar yang digunakan untuk membuat larutan stok BFB adalah KH₂PO₄ 34 g ditambahkan aquades 500 ml. Selanjutnya membuat larutan kerja dengan cara mengambil larutan BFB stok 10 ml dan tambahkan 990 ml aquades, homogenkan dan distribusikan 225 ml larutan kerja BFB setiap erlemeyer untuk pengkayaan dan 9 ml setiap tabung reaksi kapas ukuran 20 mm x 150 mm untuk pengenceran. Larutan BFB berwarna putih dan cair. Setelah larutan kerja BFB didistribusikan, mulut erlemeyer ditutup menggunakan alumunium foil dan tabung reaksi dibungkus menggunakan kertas dan diikat menggunakan karet gelang agar tidak terkontaminasi dan dapat menyerap uap air. Selanjutnya disterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121ºC selama 15 menit. Kemudian larutan BFB disimpan ke dalam LAF dengan suhu ruang (27ºC) selama 24 jam, setelah itu disimpan ke dalam lemari pendingin (show case). Media BFB dapat dilihat pada Gambar 6.

 

Gambar 6. Media Butterfield’s Phospate Buffered (BFB)

 (Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

b.  Media Lauryl Triptose Broth (LTB)

     Pada pengujian mikrobiologi bakteri Escherechia coli,  media LTB digunakan untuk uji pendugaan coliform. Komposisi LTB yaitu Tryptose atau trypticase 20 g, Lactose 5 g, K₂HPO₄ 2,75 g, KH₂PO₄ 2,75 g, NaCl 5 g, Sodium lauryl sulfate 0,1 g dan aquades 1 liter (SNI 2332:2006).

    Berdasarkan petunjuk penggunaan pada kemasan produk media LTB di Balai KIPM Kelas II Semarang, langkah untuk pembuatan media LTB yaitu  dengan menimbang LTB sebanyak 35,6 g, lalu ditambahkan aquades 1 liter. Selanjutnya dihomogenkan di dalam beaker glass yang diberi magnetic stirer menggunakan hot plate tanpa pemanasan. Lalu didistribusikan ke dalam tabung reaksi kapas ukuran 20 mm x 150 mm sebanyak 9 ml per tabung kemudian dimasukkan tabung durham 10 mm x 75 mm. Setiap 10 tabung reaksi berisi media LTB dibungkus dengan kertas dan diikat dengan karet gelang selanjutnya autoclave dengan suhu 121ºC selama 15 menit kemudian tunggu hingga suhu media tidak terlalu panas. Lalu media disimpan ke dalam LAF dengan suhu ruang (27ºC) selama 24 jam, setelah itu disimpan ke dalam lemari pendingin (show case). Media LTB dapat dilihat pada Gambar 7.

          

Gambar 7. Media Lauryl Triptose Broth (LTB)

 (Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

c.   Media EC Broth

     Pada pengujian mikrobiologi bakteri Escherechia coli, media  EC Broth digunakan untuk uji pendugaan Escherechia coli. Komposisi EC Broth yaitu Tryptose atau trypticase 20 g, Bile salt No. 31,5 g, Lactose 5 g, K₂HPO₄ 4 g, KH₂PO₄ 1,5 g, NaCl 5 g, dan aquades 1 liter (SNI 2332:2006).

            Berdasarkan petunjuk penggunaan pada kemasan produk media EC broth di Balai KIPM Kelas II Semarang, langkah untuk pembuatan media EC broth yaitu  dengan menimbang EC broth sebanyak 37 g, lalu ditambahkan aquades 1 liter. Selanjutnya dihomogenkan di dalam beaker glass yang diberi magnetic stirer menggunakan hot plate tanpa pemanasan. Lalu didistribusikan ke dalam tabung reaksi kapas sebanyak 9 ml per tabung reaksi kapas ukuran 20 mm x 150 mm kemudian dimasukkan tabung durham ukuran 10 mm x 75 mm. Setiap 10 tabung reaksi berisi media EC broth dibungkus dengan kertas dan diikat dengan karet gelang selanjutnya autoclave dengan suhu 121ºC selama 15 menit kemudian tunggu hingga suhu media tidak terlalu panas. Lalu media disimpan ke dalam LAF dengan suhu ruang (27ºC) selama 24 jam, setelah itu disimpan ke dalam lemari pendingin (show case). Media EC broth dapat dilihat pada Gambar 8.

Gambar 8. Media EC broth (Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

d.  Media Levine Eosin Methylene Blue (L-EMB) Agar

     Pada pengujian mikrobiologi bakteri Escherechia coli, media  Levine Eosin Methylene Blue (L-EMB) Agar digunakan untuk uji penegasan  Escherechia coli. Komposisi L-EMB agar yaitu Peptone 10 g, Lactose 10 g, K₂HPO₄ 2 g, Bacto agar 15 g, Eosin 0,4 g, Methylen blue 0,065 g, dan aquades 1 liter (SNI 2332:2006).

     Berdasarkan petunjuk penggunaan pada kemasan produk media L-EMB agar di Balai KIPM Kelas II Semarang, langkah untuk pembuatan media L-EMB agar yaitu  dengan menimbang L-EMB agar sebanyak 36 g, lalu ditambahkan aquades 1 liter. Selanjutnya dihomogenkan di dalam erlemeyer yang diberi magnetic stirer menggunakan hot plate dan dipanaskan hingga mendidih. Setelah itu di bungkus kertas dan diikat dengan karet gelang selanjutnya  autoclave dengan suhu 121ºC selama 15 menit kemudian tunggu hingga suhu media hangat kuku. Kemudian didistribusikan ke dalam cawan petri sebanyak 20 ml per cawan dan ditunggu hingga padat. Selanjutnya media disimpan ke dalam LAF dengan suhu ruang (27ºC) selama 24 jam, setelah itu disimpan ke dalam lemari pendingin (show case). Media Levine Eosin Methylene Blue (L-EMB) Agar

dapat dilihat pada Gambar 9.

                             Gambar 9. Media Levine Eosin Methylene Blue (L-EMB) Agar

(Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

e.   Media Plate Count Agar (PCA)

     Pada pengujian mikrobiologi bakteri Escherechia coli, media Plate Count Agar (PCA) digunakan untuk uji penegasan  Escherechia coli, diinokulasi dari media L-EMB agar. Komposisi PCA yaitu Tryptone 5 g, Yeast extract 22,5 g, Dextrose 1 g, Bacto agar 15 g dan aquades 1 liter (SNI 2332:2006).

     Berdasarkan petunjuk penggunaan pada kemasan produk media PCA di Balai KIPM Kelas II Semarang, langkah untuk pembuatan media PCA yaitu  dengan menimbang PCA sebanyak 22,5 g, lalu ditambahkan aquades 1 liter. Selanjutnya dihomogenkan di dalam beaker glass  yang diberi magnetic stirer menggunakan hot plate dan dipanaskan hingga mendidih. Setelah itu didistribusikan ke dalam tabung reaksi kapas ukuran 20 mm x 150 mm sebanyak 6 ml. Setiap 10 tabung reaksi berisi media PCA dibungkus dengan kertas dan diikat dengan karet gelang selanjutnya autoclave dengan suhu 121ºC selama 15 menit kemudian tunggu hingga suhu media hangat kuku. Selanjutnya media diatur dalam posisi  miring (slant) di dalam LAF dengan suhu ruang (27^oC) selama 24 jam, setelah itu disimpan ke dalam lemari pendingin (show case). Media Plate Count Agar (PCA) dapat dilihat pada Gambar 10.

Gambar 10. Media Plate Count Agar (PCA)

 (Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

f.    Media Indol atau Tryptone atau Trypcase Broth (TB)

     Pada pengujian mikrobiologi bakteri Escherechia coli, media Indol digunakan untuk uji biokim. Komposisi Indol yaitu Tryptone atau Trypcase 10 g dan aquades 1 liter (SNI 2332:2006).

     Berdasarkan petunjuk penggunaan pada kemasan produk media Indol di Balai KIPM Kelas II Semarang, langkah untuk pembuatan media Indol yaitu  dengan menimbang Indol sebanyak 25,5 g, lalu ditambahkan aquades 1 liter. Selanjutnya dihomogenkan di dalam beaker glass  yang diberi magnetic stirer menggunakan hot plate dan dipanaskan hingga mendidih. Setelah itu didistribusikan ke dalam tabung reaksi ulir ukuran 16 mm x 150 mm sebanyak 3 ml per tabung. Setiap 10 tabung reaksi berisi media Indol dibungkus dengan kertas dan diikat dengan karet gelang selanjutnya autoclave dengan suhu 121ºC selama 15 menit kemudian tunggu hingga suhu media hangat kuku. Selanjutnya media disimpan di dalam LAF dengan suhu ruang (27^oC) selama 24 jam, setelah itu disimpan ke dalam lemari pendingin (show case). Media Indol dapat dilihat pada Gambar 11.

Gambar 11. Media Indol (Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

g.  Media MR-VP Broth

     Pada pengujian mikrobiologi bakteri Escherechia coli, media MR-VP Broth digunakan untuk uji biokim. Komposisi MR-VP Broth yaitu terdiri dari medium 1 dan medium 2. Medium 1 antara lain Buffered Peptone water powder 7  g, Glucose 5 g, KH₂PO₄ 5 g dan aquades 1 liter sedangkan  medium 2 antara lain Pancreatic digest casein 3,5 g, peptic digest dari jaringan hewan 3,5 g, Dextrode 5 g, Potasium phosphate 5 g, Aquades 1 liter (SNI 2332:2006).

     Berdasarkan petunjuk penggunaan pada kemasan produk media MR-VP Broth di Balai KIPM Kelas II Semarang, langkah untuk pembuatan media MR-VP Broth yaitu  dengan menimbang MR-VP Broth sebanyak 17 g, lalu ditambahkan aquades 1 liter. Selanjutnya dihomogenkan di dalam beaker glass  yang diberi magnetic stirer menggunakan hot plate tanpa pemanasan. Setelah itu didistribusikan ke dalam tabung reaksi kapas sebanyak 10 ml per tabung. Setiap 10 tabung reaksi berisi media MR-VP Broth dibungkus dengan kertas dan diikat dengan karet gelang selanjutnya autoclave dengan suhu 121ºC selama 15 menit kemudian tunggu hingga suhu media hangat kuku. Selanjutnya media disimpan dalam LAF dengan suhu ruang (27^oC) selama 24 jam, setelah itu disimpan ke dalam lemari pendingin (show case). Media MR-VP Broth dapat dilihat pada Gambar 12.

Gambar 12. Media MR-VP Broth (Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

h.  Media Simmon Citrate Agar

     Pada pengujian mikrobiologi bakteri Escherechia coli, media Simmon Citrate Agar digunakan untuk uji biokim. Komposisi Simmon Citrate Agar digunakan yaitu Sodium citrate 2 g, NaCl 5 g, K₂HPO₄ 1 g, NH₄H₂PO₄ 1 g, MgSO₄ 0,2 g, Bromthymol blue 0,08 g, Bacto agar 15 g  dan aquades 1 liter (SNI 2332:2006).

     Berdasarkan petunjuk penggunaan pada kemasan produk media Simmon Citrate Agar digunakan di Balai KIPM Kelas II Semarang, langkah untuk pembuatan media Simmon Citrate Agar digunakan yaitu  dengan menimbang Simmon Citrate Agar digunakan sebanyak 22,5 g, lalu ditambahkan aquades 1 liter. Selanjutnya dihomogenkan di dalam beaker glass  yang diberi magnetic stirer menggunakan hot plate dan dipanaskan hingga mendidih. Setelah itu didistribusikan ke dalam tabung reaksi kapas sebanyak 6 ml per tabung. Setiap 10 tabung reaksi berisi media Simmon Citrate Agar digunakan dibungkus dengan kertas dan diikat dengan karet gelang selanjutnya autoclave dengan suhu 121ºC selama 15 menit kemudian tunggu hingga suhu media hangat kuku. Selanjutnya media diatur dalam posisi  miring (slant) di dalam LAF dengan suhu ruang (27^oC) selama 24 jam, setelah itu disimpan ke dalam lemari pendingin (show case). Media Simmon Citrate Agar dapat dilihat pada Gambar 13.

Gambar 13. Media Simmon Citrate Agar

 (Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)