Tahapan Pengujian Bakteri Escherechia coli

a.   Uji Pendugaan Coliform (Presumtive Coliform)

·     Siapkan pengenceran 10² dengan cara melarutkan 1 mL larutan 10¹ ke dalam 9 mL larutan pengencer BFB sampai pengenceran 10³. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali.

·      Diambil sebanyak 1 mL larutan dari setiap pengenceran menggunakan pipet steril ke dalam 3 tabung LTB yang berisi tabung durham 3 seri.

·      Selanjutnya tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 35^oC ± 0,5^oC. Gas yang terbentuk setelah inkubasi 24 jam ± 2 jam diamati. Tabung positif ditandai dengan keruhan dan gas dalam tabung durham. Diinkubasikan kembali tabung-tabung negatif selama 24 jam dan dicatat hasilnya pada 48 jam ± 3 jam.

·      Dilakukan uji penegasan koliform untuk tabung-tabung positif. Kegiatan Uji Pendugaan Coliform dapat dilihat pada Gambar 21.

                                                   Gambar 21. Uji Pendugaan Coliform

(Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

b.  Uji Pendugaan E. coli (Faecal Coliform, Presumtive E. coli)

·      Inokulasikan dari setiap tabung LTB yang positif ke tabung-tabung EC broth yang berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose. Diinkubasi EC broth dalam waterbath sirkulasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 45.5^oC ± 0,2^oC. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi.

·      Tabung-tabung EC broth yang menghasilkan gas selama 24 jam ± 2 jam diperiksa, jika negatif diinkubasikan kembali dan diperiksa pada 48 ± 2 jam. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.

·      Ditentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) untuk fekal koliform berdasarkan jumlah tabung-tabung EC yang positif. Nilai APM fekal koliform dinyatakan sebagai APM/g untuk produk perikanan. Pengujian menggunakan 3 seri tabung pengenceran. Kegiatan Uji Pendugaan Escherechia coli dapat dilihat pada Gambar 22.

                                        Gambar 22. Uji Pendugaan Escherechia coli

(Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

c. Uji Penegasan E. coli (Confirmed E. coli)

·      Sampel dari tabung-tabung EC broth yang positif digoreskan menggunakan jarum ose gores ke L-EMB agar. Inkubasi selama 18 – 24 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC.

·      Koloni E. coli terduga memberikan ciri yang khas (typical) yaitu hitam pada bagian tengah, datar dan dengan atau tanpa hijau metalik.

·      Diambil sampai dengan 5 koloni tipikal E. coli dari masing-masing cawan L-EMB agar dan goreskan ke media PCA miring dengan menggunakan jarum ose. Inkubasi selama 18 – 24 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC, koloni dari media PCA miring digunakan untuk pengujian selanjutnya. Kegiatan Uji Penegasan Escherechia coli dapat dilihat pada Gambar 23.

Gambar 23. Uji Penegasan Escherechia coli

 (Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

d. Uji Morfologi

     Dilakukan uji morfologi dengan melakukan pewarnaan gram dari setiap koloni Escherechia coli terduga. Biakan diambil dari PCA yang telah diinkubasi selama 24 jam. Setelah itu diamati dengan menggunakan mikroskop. Bakteri Escherechia coli  termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek atau coccus. Prosedur pewarnaan gram pada Bakteri Escherechia coli  sesuai dengan Standar Nasional Indonesia 2332.1-2006 adalah sebagai berikut:

·      Buat usapan bakteri yang akan diwarnai ke atas gelas preparat. Usahakan usapan yang dibuat setipis mungkin.

·      Fiksasi gelas preparat tersebut dengan melewatkan melalui api burner.

·      Warnai film selama 1 menit dengan larutan Hucker’s Crystal violet dan cuci sebentar dengan air.

·      Bubuhkan larutan gram iodine selama 1 menit dan cuci dengan air mengalir.

·      Lakukan dekolorisasi (penghilangan warna) dengan Ethanol 95% hingga seluruh warna biru hilang (kira-kira 30 detik). Cuci kembali dengan air mengalir.

·      Bubuhkan larutan counterstain (safranin) selama 1 menit dan cuci kembali dengan air mengalir. Selanjutnya dikeringkan dan amati dengan mikroskop. Kegiatan Uji Morfologi Escherechia coli dapat dilihat pada Gambar 24.

Gambar 24. Uji Morfologi Escherechia coli

(Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)

e. Uji Biokim

·      Produksi Indol

          Diinokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam tryptone broth dan diinkubasikan selama 24 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC. Uji indol dilakukan dengan menambahkan 0,2 mL – 0,3 mL pereaksi Kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning.

·      Uji Voges Proskauer

     Diinokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam MRVP broth. Selanjutnya diinkubasikan selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC. Diambil sebanyak 1 mL dari setiap MRVP broth yang tumbuh ke tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm steril dan ditambahkan 0,6 mL larutan alpha naphtol dan 0,2 mL 40% KOH, kocok dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif jika terbentuk warna merah muda eosin sampai merah delima (ruby).

·      Uji Methyl Red

    Diinkubasikan kembali MRVP broth selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC. Ditambahkan 5 tetes indikator methyl red pada setiap MRVP broth. Reaksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna kuning.

·      Uji Sitrat

     Digoreskan 1 ose dari PCA miring ke permukaan Simmon Citrate agar. Selanjutnya diinkubasikan selama 96 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC. Reaksi positif jika terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau.

·      Produksi Gas dari Laktosa

     Diinokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam LTB. Lalu diinkubasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35^oC ± 0,5^oC. Reaksi positif jika menghasilkan gas pada tabung durham. Kegiatan Uji Biokim Escherechia coli dapat dilihat pada Gambar 25.

                                                 Gambar 25. Uji Biokim Escherechia coli

(Balai KIPM Kelas II Semarang, 2017)